體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一種在離體狀態(tài)下模擬生物體生長(zhǎng)環(huán)境，檢測(cè)醫(yī)療器械及生物材料接觸機(jī)體組織后所發(fā)生的細(xì)胞溶解、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和其他毒性作用的體外試驗(yàn)。

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在完成物理和化學(xué)性能、加工性能以及外形等有效評(píng)價(jià)后，醫(yī)療器械生產(chǎn)商需要根據(jù)ISO或GB/T規(guī)定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生物相容性評(píng)估，將醫(yī)療器械的風(fēng)險(xiǎn)性降至最低。

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)體系中最重要的檢測(cè)指標(biāo)之一，也是醫(yī)療器械及生物材料臨床應(yīng)用前的必選項(xiàng)目；如一次性醫(yī)用口罩，醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉敷料，牙科種植導(dǎo)板，一次性使用無菌采樣拭子，一次性使用手術(shù)衣，一次性穿刺微創(chuàng)擴(kuò)張器套件，醫(yī)用霧化器等，均需進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)以對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)估。

目的:評(píng)級(jí)醫(yī)療器械和生物材料致細(xì)胞毒性反應(yīng)的潛在性，并預(yù)測(cè)最終生物體應(yīng)用時(shí)的組織細(xì)胞反應(yīng)。通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可檢測(cè)供試品接觸細(xì)胞后細(xì)胞發(fā)生生長(zhǎng)抑制、功能改變、細(xì)胞溶解、死亡或其他毒性反應(yīng)。

意義:可在短時(shí)間內(nèi)較經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便地篩選出批量供試品的細(xì)胞毒性，它為動(dòng)物試驗(yàn)的進(jìn)行與否提供了先決條件，對(duì)新型醫(yī)療器械及生物材料的研制和應(yīng)用提供了重要保證。（）

GB/T 16886.5-2017醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices— Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity.

 GB/T 14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2部分：生物 學(xué)試驗(yàn)方法

YY/T 0127.9-2009口腔醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第2單元 試驗(yàn)方法 細(xì)胞毒性試驗(yàn)：瓊脂擴(kuò)散法及濾膜擴(kuò)散法

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)具有通用性，可以適用于各種醫(yī)療器械和生物材料的評(píng)價(jià)，試驗(yàn)主要分三類：浸提液試驗(yàn)，直接接觸試驗(yàn)和間接接觸試驗(yàn)。

選擇哪種方法進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，需根據(jù)醫(yī)療器械產(chǎn)品的材料，與機(jī)體相互作用途徑來選擇。當(dāng)一個(gè)評(píng)價(jià)項(xiàng)目可用多種試驗(yàn)方法時(shí)，應(yīng)考慮試驗(yàn)的原理、靈敏性、可選性、可定量性、重現(xiàn)性、試驗(yàn)材料的適用性及局限性等因素進(jìn)行選擇。

例如：

浸提液法適合檢測(cè)溶出物的毒性；

直接接觸法對(duì)材料的細(xì)胞毒性敏感性最高，可檢測(cè)出材料微弱的細(xì)胞毒性；

間接接觸法中的適合于毒性大的材料檢驗(yàn)；

以上各種方法因原理不同，各有特點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)材料本身理化性質(zhì)、毒性作用強(qiáng)弱及其用途，正確地選擇試驗(yàn)方法。

(移出細(xì)胞)

細(xì)胞種板

使用胰蛋白酶消化培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞，使貼壁細(xì)胞懸浮。

將細(xì)胞移入離心管，放入離心機(jī)，3000rpm離心3分鐘后，去除上清液。

加入培養(yǎng)基配制接種濃度的細(xì)胞懸液。

將配制好的細(xì)胞懸液接種于96孔板、6孔板或培養(yǎng)皿中，隨后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求培養(yǎng)對(duì)應(yīng)時(shí)長(zhǎng)。

(離心)

樣品浸提及換液

無菌操作制備樣品，根據(jù)浸提比例加入浸提介質(zhì)。在37℃下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案浸提24小時(shí)或72小時(shí)。同時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照。

浸提完成后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用浸提液更換細(xì)胞培養(yǎng)液，具體操作如下。

MTT法:棄去原培養(yǎng)液,空白對(duì)照組加入空白對(duì)照浸提液,陰性對(duì)照組加入陰性對(duì)照品浸提液,陽性對(duì)照組加入陽性對(duì)照品浸提液,供試品組分別加入100uL不同濃度的樣品浸提液(100%、75%、50%、25%),換液后放二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。

直接接觸法:棄去原培養(yǎng)液,加入2mL新鮮培養(yǎng)液,將制備好的樣品輕放于中央細(xì)胞層上，隨后放入二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。

間接接觸法:按標(biāo)準(zhǔn)要求在培養(yǎng)皿中放入空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、樣品浸提液潤(rùn)濕的濾紙片，二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。

(樣品更換培養(yǎng)液)

結(jié)果觀察

(測(cè)定吸光度)

MTT法:培養(yǎng)完成，將試驗(yàn)板置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。觀察完成后，棄去浸提液,每孔加入50uL質(zhì)量濃度為1mg/mL的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。棄去孔內(nèi)MTT溶液,加入100uL異丙醇,置振蕩器上振蕩10分鐘,在酶標(biāo)儀570nm和650nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,計(jì)算相對(duì)增殖率(RGR),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判定樣品是否存在細(xì)胞毒性。

直接接觸法:加入樣品培養(yǎng)24小時(shí)后,在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、空泡形成、脫落、細(xì)胞溶解和膜完整性等,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

間接接觸法:加入樣品培養(yǎng)24小時(shí)后,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),測(cè)量褪色面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判定檢驗(yàn)結(jié)果。濾膜擴(kuò)散試驗(yàn)在此步進(jìn)行染色。

1）產(chǎn)品原材料本身；

2）產(chǎn)品中含有明顯的細(xì)胞毒性，如帶藥物球囊導(dǎo)管、帶涂層的導(dǎo)管導(dǎo)絲；

3）選擇的試驗(yàn)方法是否適合本產(chǎn)品，如凝膠類、膏狀類、帶顏色液體類產(chǎn)品不適合采用浸提法；灌流器產(chǎn)品，灌流器中的活性炭和吸附樹脂會(huì)對(duì)吸附含血清培養(yǎng)基中的血清的有效營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致浸提液中的血清成分不足，這類產(chǎn)品可能不適用于用含血清培養(yǎng)基浸提。

4）產(chǎn)品暴露于浸提介質(zhì)是否改變pH值，如產(chǎn)品加入浸提介質(zhì)后，顏色從粉色變成黃色等。

5）帶預(yù)沖液產(chǎn)品的處理；

6）環(huán)氧乙烷滅菌后的殘留量；

樣品細(xì)胞毒出現(xiàn)陽性并不意味著不能應(yīng)用于臨床，細(xì)胞毒性的結(jié)果還應(yīng)結(jié)合其他試驗(yàn)數(shù)據(jù)，如材料的物理化學(xué)表征、產(chǎn)品組成及預(yù)期用途等因素進(jìn)行綜合評(píng)估，當(dāng)試驗(yàn)出現(xiàn)毒性結(jié)果的時(shí)候，可采取進(jìn)一步評(píng)價(jià)進(jìn)行解釋，例如：