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遺傳毒性試驗(yàn)

遺傳毒性試驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)對(duì)遺傳物質(zhì)的毒性作用的實(shí)驗(yàn)方法，主要包括基因突變和染色體畸變等檢測(cè)。這些實(shí)驗(yàn)方法可以評(píng)估化學(xué)物質(zhì)對(duì)DNA和染色體的損傷程度，從而預(yù)測(cè)其可能對(duì)人體造成的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要使用標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)方法，遵循GLP原則，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。遺傳毒性試驗(yàn)對(duì)于評(píng)估化學(xué)物質(zhì)的致癌性和致畸性具有重要意義，可以為化學(xué)品的安全性評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

遺傳毒性試驗(yàn)的目的和意義如下：

目的：

1、檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)對(duì)遺傳物質(zhì)的毒性作用，評(píng)估其可能對(duì)人體造成的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。

2、預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)可能導(dǎo)致的基因突變和染色體畸變等遺傳學(xué)損傷。

意義：

1、評(píng)估化學(xué)物質(zhì)的致癌性和致畸性，為化學(xué)品的安全性評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

2、預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)可能對(duì)生殖細(xì)胞產(chǎn)生的非整倍體潛在性，為生殖健康和人類(lèi)遺傳學(xué)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

3、為制定人類(lèi)接觸化學(xué)物質(zhì)的限制劑量提供科學(xué)依據(jù)，以保護(hù)人體健康和安全。

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)：

1.取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無(wú)菌小三角瓶或無(wú)菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，在（37±1）℃、（115r/min～125 r/min）振蕩培養(yǎng)10h～12h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活菌數(shù)不少于1×10⁹cfu/mL。融化頂層培養(yǎng)基分裝于無(wú)菌小試管，每管2mL，在45℃水浴中保溫。

2.在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入樣品液0.1ml、新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物0.1ml和10%S9混合液0.5mL。無(wú)活化組加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL。試管內(nèi)容物混合后鋪至最低瓊脂營(yíng)養(yǎng)平板的表面。在培養(yǎng)前待頂層瓊脂固化。樣品組分別設(shè)三個(gè)平行皿。

3. 陰性對(duì)照組分別加入0.1mL浸提介質(zhì)和新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物0.1ml，活化組再加10%S9混合液0.5mL，無(wú)活化組加0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL；陽(yáng)性對(duì)照組分別加入誘變劑0.1mL和新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物0.1ml，活化組再加10% S9混合液0.5mL，無(wú)活化組加入0.2mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL。陰性及陽(yáng)性對(duì)照組分別設(shè)三個(gè)平行皿。全部平皿置37℃倒置培養(yǎng)48～72h觀察結(jié)果。

體外哺乳動(dòng)物染色體畸變?cè)囼?yàn)：

1、試驗(yàn)分為短期接觸組（有和無(wú)代謝活化系統(tǒng)）和長(zhǎng)期接觸組（無(wú)代謝活化系統(tǒng)）。短期接觸組接觸4h，長(zhǎng)期接觸組接觸24h。

2.接觸處理：試驗(yàn)前接種一定數(shù)量細(xì)胞，置于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。一天后棄培養(yǎng)液，0.9%氯化鈉注射液組加入對(duì)照品或供試品、S9混合液（不加S9混合液時(shí)，需用培養(yǎng)液補(bǔ)足）以及培養(yǎng)液。0.9%氯化鈉注射液浸提液的終濃度為10%。含血清培養(yǎng)基組加入對(duì)照品或供試品、S9混合液（不加S9混合液時(shí)，需用培養(yǎng)液補(bǔ)足）。全部置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中。短期接觸組接觸結(jié)束后吸去培養(yǎng)皿中的液體，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。于24h內(nèi)收獲細(xì)胞，收獲前4h加入終濃度為1μg/mL秋水仙素。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組同法制備。

3.收獲細(xì)胞與制片：消化細(xì)胞后加含血清培養(yǎng)液收集細(xì)胞。加入0.075mol/L氯化鉀溶液低滲處理后，加入固定液（甲醇：冰醋酸，3:1混合）進(jìn)行固定，固定結(jié)束后離心棄上清，加入數(shù)滴新鮮固定液滴片，空氣干燥后用姬姆薩染液染色。

4.結(jié)果評(píng)價(jià)：在光學(xué)顯微鏡下每一試驗(yàn)組選擇300個(gè)分散良好的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行染色體畸變分析，記錄畸變細(xì)胞數(shù)。

小鼠淋巴瘤細(xì)胞（TK）基因突變?cè)囼?yàn)：

1、 接觸處理：取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，調(diào)整密度為1×10⁶/mL，無(wú)活化系統(tǒng)組取10mL細(xì)胞懸液與9mL試驗(yàn)或?qū)φ諛悠芬约?50mmol/L氯化鉀溶液1mL混合；有活化系統(tǒng)組取10mL細(xì)胞懸液，加入9mL試驗(yàn)或?qū)φ諛悠芬约癝9混合液，37℃震搖處理4小時(shí)（有和無(wú)活化系統(tǒng)）和24小時(shí)（無(wú)活化系統(tǒng)）。振蕩頻率為（70～80）r/min。處理結(jié)束后離心，棄上清液，用PBS 或不含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2 遍，重新懸浮細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，并調(diào)整細(xì)胞密度為2×10⁵/mL。

2. PE₀平板：PE₀（0 天的平板接種效率）測(cè)定：取適量細(xì)胞懸液，作梯度稀釋至8 個(gè)細(xì)胞/mL，接種96 孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6 個(gè)細(xì)胞/孔），每個(gè)劑量作2塊板，37℃，5% CO₂，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d，計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。

3. PE₂平板：第2d表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，按PE₀接種。每天計(jì)數(shù)細(xì)胞密度并保持密度在10⁶/mL 以下。

4. TEF拮抗平板：第2d 表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后，取適量細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁴/mL，加入TFT（三氟胸苷，終濃度為3μg/mL），混勻，接種96 孔板（每孔加0.2 mL，即平均2000 個(gè)細(xì)胞/孔），每個(gè)劑量作2塊板，37℃，5% CO₂，飽和濕度條件下培養(yǎng)12d，計(jì)數(shù)有突變集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。

5. 結(jié)果評(píng)價(jià)：對(duì)每塊平板計(jì)算無(wú)集落生長(zhǎng)的孔數(shù)，對(duì)TFT抗性拮抗平板應(yīng)計(jì)算無(wú)小集落孔數(shù)、無(wú)集落孔數(shù)。每個(gè)劑量組數(shù)據(jù)求平均數(shù)，

哺乳動(dòng)物骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)：

1.選用50只體重在25～30g范圍內(nèi)的SPF級(jí)KM小鼠，分為5組，每個(gè)劑量組10只，雌雄各半。

2. 動(dòng)物染毒采用兩次腹腔注射或尾靜脈注射，連續(xù)2d，即兩次染毒間隔24h，第二次染毒后6h取材。注射量為20mL/kg。

3. 用頸椎脫臼法處死動(dòng)物，取出股骨。剔除肌肉等組織，擦凈血污。剪去股骨兩端，暴露骨髓腔。

4. 用注射器吸取0.1mL胎牛血清，沖洗骨髓腔。用沖洗液常規(guī)涂片，晾干或烘干。

5. 將干燥的涂片放入甲醇中固定5～10min，將固定過(guò)的涂片放入Giemsa 應(yīng)用液（1份Giemsa儲(chǔ)存液：6份1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液混合而成,臨用現(xiàn)配），染色10～15min，然后用pH6.8 PBS液沖洗，晾干。

6. 在油鏡下觀察觀察計(jì)數(shù)含微核的嗜多染紅細(xì)胞（PCE）數(shù)以及觀察PCE/NCE（寫(xiě)好標(biāo)簽成熟紅細(xì)胞）的比例。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE，計(jì)算微核細(xì)胞率，以千分率表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用泊松分布方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。同時(shí)，計(jì)數(shù)200個(gè)PCE，并記數(shù)所見(jiàn)到的NCE。

7. 陽(yáng)性與陰性對(duì)照組的操作程序同供試品組。