無(wú)菌檢查法（Sterility tests）

顧名思義就是檢查是否無(wú)菌，系用于檢查藥典要求無(wú)菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器械、原料、輔料及其他品種是否無(wú)菌的一種方法。凡直接進(jìn)入人體血液循環(huán)系統(tǒng)、植入或埋入肌肉、皮下組織、與創(chuàng)傷部位接觸的產(chǎn)品、材料或器械，以及醫(yī)學(xué)使用上要求無(wú)菌的品種都屬于藥典要求無(wú)菌的產(chǎn)品，可以按本法進(jìn)行無(wú)菌檢查。

無(wú)菌檢查法是為檢測(cè)無(wú)菌工藝產(chǎn)品和終端滅菌產(chǎn)品的無(wú)菌性而建立，在藥典規(guī)定的培養(yǎng)條件下檢查活的可培養(yǎng)微生物的一種定性檢查方法。由于微生物污染分布的不均勻性，特別是微生物污染率較低時(shí)，無(wú)菌檢查的結(jié)論具有一定的局限性。產(chǎn)品的無(wú)菌性取決于生產(chǎn)全過(guò)程中良好的無(wú)菌保證體系、經(jīng)驗(yàn)證的有效滅菌工藝和遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求管理，并嚴(yán)格執(zhí)行產(chǎn)品在儲(chǔ)存、運(yùn)輸、使用等環(huán)節(jié)中的防污染措施。所以，供試品若符合無(wú)菌檢查法的規(guī)定，僅表明供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。

認(rèn)識(shí)無(wú)菌檢查法

除了培養(yǎng)基制備、儲(chǔ)存和稀釋液、沖洗液配制等準(zhǔn)備工作，無(wú)菌檢查法實(shí)際包含3個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)，分別為：培養(yǎng)基適用性檢查、方法適用性試驗(yàn)和供試品的無(wú)菌檢查。

培養(yǎng)基適用性檢查：主要目的有兩個(gè)，一是確認(rèn)使用的培養(yǎng)基本身是無(wú)菌的，即無(wú)菌性檢查，通過(guò)在適宜溫度下放置培養(yǎng)基觀察判定；二是確認(rèn)使用的培養(yǎng)基細(xì)菌或真菌是可以舒舒服服生長(zhǎng)并且在規(guī)定時(shí)間內(nèi)可以被觀察到，即靈敏性檢查，通過(guò)接種特定菌種，觀察菌生長(zhǎng)狀態(tài)判斷。進(jìn)行了以上實(shí)驗(yàn)，就可以判斷檢測(cè)不到細(xì)菌真菌，不是培養(yǎng)基自身造成的。

方法適用性試驗(yàn)：主要目的是判斷采用的方法，薄膜過(guò)濾法或者直接接種法，是否適用于你要檢測(cè)的這種產(chǎn)品。尤其是一些產(chǎn)品，本身就含有抑菌成分，這種情況下難道在整個(gè)檢驗(yàn)期內(nèi)結(jié)果呈現(xiàn)陰性，就是真的無(wú)菌了嗎？答案是不一定的，因此我們需要排除檢驗(yàn)過(guò)程中操作或者產(chǎn)品本身的抑菌性。當(dāng)一個(gè)新產(chǎn)品進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)或者實(shí)驗(yàn)條件改變時(shí)，需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，可與供試品無(wú)菌檢查同步進(jìn)行。

供試品的無(wú)菌檢查：這就是實(shí)打?qū)嵉膶?duì)于產(chǎn)品的無(wú)菌檢測(cè)，從檢測(cè)數(shù)量、檢驗(yàn)量、陰/陽(yáng)性對(duì)照、接種要求、培養(yǎng)觀察和結(jié)果判讀全都進(jìn)行了細(xì)致規(guī)定。談?wù)剻z測(cè)數(shù)量和檢驗(yàn)量，檢測(cè)數(shù)量是一批次一定數(shù)量的產(chǎn)品中需要抽檢的數(shù)量，檢驗(yàn)量是每瓶/支中要取多少體積的供試品用于檢測(cè)。對(duì)于檢測(cè)數(shù)量和檢測(cè)量的規(guī)定更好更全面地評(píng)估了整批樣品的無(wú)菌性。

無(wú)菌檢查要求

（1）無(wú)菌檢查應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，試驗(yàn)環(huán)境必須達(dá)到無(wú)菌檢查的要求，檢驗(yàn)全過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。

（2）單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及受控環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度確認(rèn)。隔離系統(tǒng)應(yīng)定期按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無(wú)菌檢查的要求。

（3）日常檢驗(yàn)需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

注：“受控環(huán)境”主要的關(guān)注指標(biāo)應(yīng)該是懸浮粒子、浮游菌和沉降菌受控，其他如壓差、溫濕度等的指標(biāo)和監(jiān)測(cè)頻度也應(yīng)滿足《藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則》的要求。

培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件

（1）培養(yǎng)基可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基或商品化的預(yù)制培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。

（2）制備好的培養(yǎng)基若不即時(shí)使用，應(yīng)置于無(wú)菌密閉容器中，在2~25°C 、避光的環(huán)境下保存，并在經(jīng)驗(yàn)證的保存期內(nèi)使用。

注：新版藥典將“成品培養(yǎng)基”調(diào)整為“商品化的預(yù)制培養(yǎng)基”。新版藥典不再?gòu)?qiáng)調(diào)“非密閉-三周”、“密閉-一年”的規(guī)定，便于企業(yè)實(shí)踐掌握；但企業(yè)應(yīng)最好具備穩(wěn)定的驗(yàn)證過(guò)程和結(jié)果，以支持封閉條件和保存周期。

培養(yǎng)基的適用性檢查

無(wú)菌性檢查每批培養(yǎng)基一般隨機(jī)取不少于5 支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14 天， 應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

注：應(yīng)考慮實(shí)踐中用于無(wú)菌性檢查培養(yǎng)的試管裝滅菌培養(yǎng)基與無(wú)菌檢驗(yàn)用的三角瓶裝培養(yǎng)基在滅菌方法驗(yàn)證時(shí)的兩種包裝的溫度、F0等結(jié)果。

（上圖為 試驗(yàn)常用金黃色葡萄球菌）

菌種

培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存和確認(rèn)， 以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。

對(duì)于不同來(lái)源的菌株，國(guó)家藥典委在2018年ICH Q4藥典相關(guān)檢測(cè)方法專題研討會(huì)給出的協(xié)調(diào)建議是“基本一致，可以協(xié)調(diào)，不同來(lái)源菌株一致性需進(jìn)行驗(yàn)證”。中國(guó)藥典<9203>藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理原則中也談到“標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)”，<1101>中卻并沒(méi)有提及可以使用等效菌株代替。而美國(guó)藥典<71>里也并未提及同<61>“equivalent strains”。

如何判斷不同的編號(hào)和機(jī)構(gòu)的同一種菌具有等效性呢？如何開(kāi)展相關(guān)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)？這一點(diǎn)其實(shí)沒(méi)有明確的定論。

無(wú)菌檢查方法

直接接種法：

薄膜過(guò)濾法：

薄膜過(guò)濾法一般采用封閉式薄膜過(guò)濾器，根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)，對(duì)水溶性液體供試品、水溶性固體和半固體供試品、非水溶性供試品、可溶于十四烷酸異丙醇的膏劑和黏性油劑供試品、無(wú)菌氣霧劑供試品、裝有藥物的注射器供試品、具有導(dǎo)管的醫(yī)療器械（輸血、輸液袋等）供試品等多種特性試樣進(jìn)行無(wú)菌檢查。

美國(guó)藥典章節(jié)USP<71>，歐洲藥典2.6.1以及中國(guó)藥典相關(guān)章節(jié)都明確規(guī)定“只要產(chǎn)品性質(zhì)允許，就必須使用薄膜過(guò)濾法”。

膜過(guò)濾法的優(yōu)勢(shì)：膜過(guò)濾有助于對(duì)大體積樣品實(shí)施檢測(cè)，消除或至少能夠減少具有抗菌特性的化合物的存在，并且可確保緩慢生長(zhǎng)微生物的恢復(fù)。通過(guò)以保持生長(zhǎng)為基礎(chǔ)，該方法還可確保僅檢測(cè)到活微生物，且結(jié)果可靠。這避免了對(duì)背景或噪聲的過(guò)度關(guān)注，從而減少這些因素導(dǎo)致的誤報(bào)。

如果無(wú)菌檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，需進(jìn)行徹底的根本原因分析：

A、是否存在抗菌物質(zhì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。B、檢測(cè)期間引入的污染所致

處理方法：對(duì)流程的每一步重新檢查，以確定失敗原因。在重復(fù)檢測(cè)之前，必須執(zhí)行糾正措施。如果樣品不合格，則整個(gè)批次都視為被污染，且必須銷(xiāo)毀該批次。為了避免這種耗時(shí)且成本高昂的延遲放行，在受控環(huán)境中進(jìn)行的無(wú)菌檢測(cè)，這與無(wú)菌生產(chǎn)中采用的環(huán)境類似。近年來(lái)，越來(lái)越多的人采用隔離器等屏障技術(shù)進(jìn)行無(wú)菌檢測(cè)。

判定標(biāo)準(zhǔn)

（1）當(dāng)測(cè)試結(jié)果中，供試品管/組澄清且無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照管/組渾濁且有菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照管/組澄清且無(wú)菌生長(zhǎng)，同時(shí)無(wú)菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果符合無(wú)菌檢查法的要求，則判定該檢品無(wú)菌檢查符合要求。

（2）若供試品管/組有菌生長(zhǎng)，但通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)下列條件中有一條不符合要求則可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)無(wú)效，可取同量供試品，依法重試檢查，若無(wú)菌生長(zhǎng)，則判定供試品符合規(guī)定；若有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定。

具體條件如下：

● 無(wú)菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無(wú)菌檢查法的要求；

● 回顧無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；

● 在陰性對(duì)照中觀察到微生物生長(zhǎng)；

● 供試品管/組中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌試驗(yàn)中所使用的物品和無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的.

參考文獻(xiàn)

《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（2010年修訂）

《中國(guó)藥典》2020年版 四部通則1101無(wú)菌檢查法

《中國(guó)藥典》2020年版 四部指導(dǎo)原則9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則

《中國(guó)藥典》2020年版 四部指導(dǎo)原則9205 藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則

美國(guó)藥典USP<61> <71>

《中國(guó)藥典檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》2019年版

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